顯微鏡相機：你可以只用一個嗎？

過去十年中顯微鏡攝像機的進步現在可能意味著，對于絕大多數生物科學應用而言，實驗室可以放棄僅投資一臺高性能攝像機，該領域的**專家之一Simon Watkins，杰出教授和副教授匹茲堡大學細胞生物學教授，免疫學教授，創始人兼生物成像中心主任。

“目前幾乎所有生物科學用途的**佳解決方案是單色科學CMOS [互補金屬氧化物半導體]相機，”沃特金斯補充道。這與幾年前相比發生了巨大的變化，當時CCD [電荷耦合器件]相機是顯微鏡相機的主要支柱。

CMOS（或sCMOS）和CCD都是數碼相機中的成像傳感器 - 相當于標準35mm膠片相機中的一塊膠片。按下快門時，光線進入相機，顯微鏡上的圖像（或任何其他圖像）會曝光到傳感器上。CCD按順序轉換構成圖像的像素的測量值，而CMOS同時進行轉換。“這意味著CCD的讀數通過單個節點推動，因此當您向傳感器添加更多像素時，您的**大幀速率會下降，”生物系統產品經理Nathan Claxton說道，尼康儀器公司的成像部門。“另一方面，使用科學CMOS，你不一定要犧牲像素的速度。”

當大約十年前科學CMOS**出現時，由于CMOS的靈敏度限制，CCD相機仍然主導著顯微鏡市場。早期的CMOS相機具有正面照明，這意味著它們的量子效率（QE） - 每個像素檢測到的入射光子的比例 - 必然是有限的。背光照明技術 - 后透薄技術 - 早已可用于CCD相機，在超低光應用中具有優勢。

前照式CMOS設備仍然是非常有用的相機，當然比傳統的CCD相機更好。然而，在過去兩年中，出現了**新一代背照式科學CMOS相機，QE大于95％，并且所有相同的低讀取噪聲和高幀率**初吸引前照式CMOS用戶相機 - 基本上取代了CCD相機。“不到五年前，CCD仍然是我們**受歡迎的顯微鏡相機。但現在，科學的CMOS已經取代了它，“克拉克斯頓說。

顯微鏡成像的標準三角形是分辨率，速度和靈敏度。

“顯微鏡成像的標準三角形一直是分辨率，速度和靈敏度。過去，如果你想在三角形上找到更多的東西，你總是不得不放棄其中一方，“卡爾蔡司顯微鏡北美產品營銷組經理Scott Olenych說。“如果你想要更快的速度，你必須放棄靈敏度或分辨率。但你可以說sCMOS擴大了這個三角形 - 而不是選擇一個或兩個邊，你可以讓它們更好。“

因此，沃特金斯博士建議，今天用戶可以選擇單個相機來滿足他們所有的顯微鏡成像需求 - 也許，除了一些利基用途，如旋轉盤共聚焦顯微鏡和單分子成像。

但是顏色怎么樣？如果您只進行明場成像，光線充足，那么彩色相機的QE通常較低也不成問題。但是當在低光下使用熒光樣品時 - 例如全內反射熒光（TIRF）顯微鏡 - 彩色相機不是您的**佳選擇。因此，如果您使用的是兩用顯微鏡，那么您不需要兩個不同的相機嗎？

有一種更簡單（也更便宜）的解決方案：使用單色sCMOS相機并將其與高速三色透照光源（二極管）配合使用，可以在紅色，綠色和藍色波長之間切換。“它收集來自三個顏色通道的圖像，我所知道的每一塊商業軟件都可以自動將它們組合在一起并平衡顏色，為您提供彩色圖像，”沃特金斯說。

**款帶有背薄傳感器的sCMOS相機進入市場的是pHotometrics的Prime 95B，這是一款144萬像素的攝像頭，可提供95％的QE（相比前照式sCMOS攝像頭的60-80％QE）。2017年11月，該公司發布了400萬像素的Prime BSI。“Prime相機提供了近乎**的靈敏度，并允許研究人員專注于相機的其他性能方面。這兩款相機的主要區別在于Prime 95B的像素比素有更大的像素，而BSI的像素更小，但更多像素，“pHotometrics的科學產品經理Rachit Mohindra解釋道。“使用較小的像素，Prime BSI成為空間分辨率的更好選擇，可以看到更精細的功能。95B具有更大的像素，對于更高的放大倍率和進一步**大化的靈敏度變得更好。“

圖像：使用Prime 95B Scientific CMOS相機拍攝的STORM超分辨率圖像。細胞類型：U2OS細胞。曝光時間：30毫秒。放大倍數：150倍（配置像素大小~73納米）。使用的重建算法：單PSF擬合的**大似然估計（MLE）方法。圖片由紐約大學醫學院的YanDOng Yin和Eli Rothenberg提供。

目前，pHotometrics憑借目前**可用的背面薄型sCMOS相機在該領域占據主導地位，但隨著其他制造商進入這個競爭激烈的領域，這種情況很快就會發生變化。

但是暫時不計算CCD。“CCD相機仍然是顯微鏡成像的重要組成部分，用于成千上萬的顯微鏡，而且每年都會購買很多顯微鏡，”Olenych指出。“由于相對較低的成本和多功能性，它們是許多人選擇用于顯微鏡成像需求的相機選項。”

此外，對于旋轉盤共聚焦顯微鏡或單分子研究中的低光成像，一些用戶可能仍然更喜歡電子倍增CCD相機，它使用片上倍增增益來實現單光子檢測靈敏度，而不會影響QE或分辨率。“這是一款研究級相機，永遠用于這兩種應用。但老實說，即使在這些情況下，我也會爭辯說，任何考慮購買新相機的人都應該考慮新的背面薄型sCMOS相機，“沃特金斯博士建議道。“你真正想要一個EMCCD相機的**時間是你**需要放大電路，這可能會產生噪音問題。”

在某些情況下，例如在共聚焦顯微鏡上使用基于陣列的探測器，或者在處理非常快的低光時，用戶仍可能發現EMCCD更好。**可以確定的方法是：將兩臺攝像機放入您將使用它們的環境中，然后測試它們。“這是購買顯微鏡相機的主要信息：測試一切，買一次，”沃特金斯博士警告說。“我看到大量買家對這些相機的懊悔。請您的供應商讓您在現實世界的實驗室條件下測試您正在考慮的相機。“

在經過深思熟慮的科學CMOS的大躍進之后，顯微鏡相機技術的下一步是什么？“到目前為止，制造商之間的競爭一直是提高相機的速度，同時增加量化寬松，”克拉克斯頓說。“現在許多sCMOS相機的QE為95％，你不能再遠離那里了。隨著更多背照式sCMOS相機的推出，它們將達到這個極限。在短期內，我們可能會看到將高QE與低噪聲相結合，同時使像素更小 - 一個大視場，但不要犧牲分辨率來做到這一點。短期內的夢想是以非常高的分辨率看待事物，但是在很大的范圍內。“