熒光顯微鏡工作原理

 熒光是物質在受到光或其他形式的電磁輻射照射時發(fā)出光能而引起的物理效應。熒光顯微鏡是利用熒光和磷光原位或結合反射和吸收來研究有機和無機物體的光學性質的光學顯微鏡。熒光顯微鏡有助于更清晰地觀察物體的亞細胞和內部結構。它是在 20 世紀初由 August K?hler、Carl Reichert 和 Heinrich Lehmann 發(fā)現的。

文章索引（點擊跳轉）

• 熒光顯微鏡工作原理

• 熒光顯微鏡的工作

• 熒光顯微鏡的組成

• 1. 熒光團

• 2. 光源

• 3. 勵磁濾波器

• 4.分色鏡

• 5. 排放過濾器

• 熒光顯微鏡的優(yōu)點

• 熒光顯微鏡的缺點

• 熒光顯微鏡的用途

熒光顯微鏡工作原理

熒光顯微鏡的工作原理通常是用染料對樣品的成分和結構進行染色。這是因為大多數細胞成分本質上是無色的。因此，它們不能容易地相互區(qū)分。用短波長光或電磁射線照射的熒光團或熒光分子傾向于發(fā)光。與入射光相比，發(fā)射光具有更長的波長。通常，輻照和發(fā)射之間的持續(xù)時間以納秒為單位，可以很容易地忽略。發(fā)射的光與入射光分開，這告訴了熒光團的確切位置。樣品的圖像是基于二次光而不是基于一次入射光產生的。

熒光顯微鏡的工作

熒光顯微鏡的工作方式與光學顯微鏡類似。它由強光源、特殊帶通濾光片和樣品的熒光標記組成。待研究的樣品置于顯微鏡下。使波長短到足以激發(fā)熒光團的光線照射到樣品上。在物鏡的幫助下，這道光線聚焦在樣本上。樣品發(fā)出的激發(fā)射線然后通過物鏡聚焦在探測器上。激發(fā)光線的主要部分通過樣品物體傳輸，而其中一部分被反射回來并到達檢測器。

熒光顯微鏡的組成

1. 熒光團

熒光團是一種在被電磁波或光波激發(fā)時能夠發(fā)光的化合物。它也被稱為熒光染料。熒光團基本上由具有各種 π 鍵的芳香基團或平面/環(huán)狀分子的組合組成。

2. 光源

光源是熒光顯微鏡最重要的組成部分之一。在這里，用于激發(fā)的最常見光源包括激光器、大功率 LED、氙弧燈、汞蒸氣燈等。

3. 勵磁濾波器

熒光顯微鏡中使用的激發(fā)濾光片通常是帶通濾光片，它允許落入特定帶寬的信號同時拒絕所有其他信號。熒光團吸收的波長很容易通過，而反射的光輻射則被阻擋。

4.分色鏡

分色鏡充當薄膜濾光片。分色鏡的主要用途是選擇性地通過小范圍顏色的光，同時反射所有其他顏色。它也被稱為精確的彩色濾光片。

5. 排放過濾器

發(fā)射濾光片是一種帶通濾光片。發(fā)射濾光片的工作類似于激發(fā)濾光片。它通過熒光團發(fā)射的光輻射，同時阻擋激發(fā)光。 

熒光顯微鏡的優(yōu)點

1. 熒光顯微鏡的靈敏度非常高，即每立方微米大約等于 50 個分子。

2. 借助熒光顯微鏡，可以將不同的分子染上不同的顏色，從而使用戶可以同時對一種物質的多個分子進行成像。

3.熒光顯微鏡比傳統(tǒng)光學顯微鏡效率更高。

4. 可用于體內和體外成像。

5. 熒光顯微鏡能夠以高精度分離單個蛋白質。

6. 熒光顯微鏡最適合成像和研究活細胞表現出的動態(tài)行為。

7. 熒光顯微鏡能夠產生高分辨率和清晰的圖像，從而加強研究。

8. 它結合了光學顯微鏡的放大特性和熒光的可視化。

9. 熒光顯微鏡可用于生成正在研究的樣品的 3D 放大圖像。

熒光顯微鏡的缺點

1. 由于稱為光漂白的過程，熒光顯微鏡中存在的熒光化合物或熒光團在受到激發(fā)時往往會隨著時間的推移失去其發(fā)光能力。當熒光團分子由于熒光期間的電子激發(fā)而受到化學損傷時，通常會發(fā)生光漂白。

2. 它只允許觀察和研究樣品中已經突出顯示并標記為熒光的某些結構。

3. 當熒光材料被光線照射時，熒光分子往往會產生化學物質，從而進一步導致光毒性。這種光毒性效應破壞了觀察樣品的原始性質。短波長光輻射的光毒性相對較高。

4. 熒光顯微鏡無法提供有關脂質雙層的信息，尤其是對于 SUV。

5. 熒光顯微鏡不能產生任何與囊泡的雙層特征或層狀有關的結論性觀察結果。

6. 探針和染料的添加往往會干擾脂質囊泡的性質，從而導致數據解釋不準確，從而破壞實驗的真實性。

7. 光誘導的脂質過氧化可能導致結構域形成。

熒光顯微鏡的用途

1. 熒光顯微鏡廣泛用于在微觀水平上以最高質量研究樣品的內部結構。

2. 熒光顯微鏡最適合研究活體生物樣本。

3. 在標記細胞或微生物的最內部結構時，通常首選這種顯微鏡。

4.有助于測量細胞或被觀察樣品的生理狀態(tài)。